南京地下铁道有限责任公司运营分公司是负责南京地铁运营工作的实体，隶属于南京地下铁道有限责任公司。运营分公司是模拟市场化运作，内部独立核算的企业，公司根据“适应市场经济要求，产权清晰、权责明确、政企分开、管理科学”的现代企业制度要求，实行总经理负责制，设有客运部、车辆部、物资设施部、票卡清分部、财务审计部、劳动人事部、企业管理部、教育培训部、技术部、安全保卫部、办公室（党政合署）等职能部门，各部门分工协作，全面承担着公司的运营和管理工作。另设有站务中心、乘务中心、票务中心、控制中心、检修一中心、检修二中心、设备中心、工务中心、通号中心、供电中心、物资中心、信息中心、机电和自动化中心等13个中心，中心下面还按照专业设有工区，具体负责运营一线的客运、车辆、设备维护保养等各项工作。运营分公司一号线编制人员998人，为接管二号线、一号线南延线和二号线东延线，至2009年底，运营分公司人员编制扩大到3000人。
运营分公司成立后首先接手运营的项目为南京地铁一号线一期工程，主要负责地铁一号线的运营工作，包括运营管理、列车运行、控制监督、员工培训及对土建设施、车辆和运营设备的保养、维修等。地铁开通后运营分公司直接面向市民，已成为南京地铁与市民直接交流的一个重要窗口。